牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代謝物殘留量測(cè)定分析方法的選擇

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

15.2.1.7 分析方法的選擇

(1)樣品處理方法

1)卡巴氧原形藥的提取方法

卡巴氧在水和丙酮等極性溶劑中溶解性差，文獻(xiàn)中通常選擇甲醇-水溶液作為組織提取液，溶液中不可避免地含有大量水溶性蛋白和色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)成分復(fù)雜并帶有顏色，使提取液混濁，嚴(yán)重影響定性與定量效果，同時(shí)污染色譜柱。在選擇提取液的試驗(yàn)中，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇-水溶液對(duì)卡巴氧提取效果不如乙腈，為此，本研究分別使用乙酸乙酯、乙腈以及二者混合液進(jìn)行樣品提取，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以乙腈作為提取液回收率普遍較低，只有40%~50%；而采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶劑的提取效果最佳，既能達(dá)到滿意的回收率，又能減少弱極性雜質(zhì)的干擾。為此，本研究采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶劑為提取液，在提取前加入中性氧化鋁于樣品中，提取過(guò)程用正己烷脫脂，以減少脂肪的干擾。提取溶液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，定容，LC-MS/MS檢測(cè)。

2) 代謝產(chǎn)物DCBX、QCA和MQCA的提取方法

DCBX、QCA和MQCA等代謝物在動(dòng)物體內(nèi)與蛋白質(zhì)以結(jié)合態(tài)存在，通?？刹捎盟崴狻A水解或酶解的方式將目標(biāo)化合物與蛋白組織分離，其中酶解的效果最好，不僅反應(yīng)條件最溫和，且與動(dòng)物組織分離最為徹底。文獻(xiàn)報(bào)道溫度和pH值對(duì)酶的生物活性影響極大，本實(shí)驗(yàn)方法選用Protease蛋白酶進(jìn)行酶解，Protease在pH8.5、溫度47℃時(shí)活性最強(qiáng)。酶解之前，先在樣品中加0.6%的甲酸溶液，置于47℃空氣浴中1h，使動(dòng)物組織中天然存在的酶失活；然后用Tris緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，加入Protease蛋白酶，置于47℃空氣浴中過(guò)夜(16～18h)。

在樣品溶液中加入0.3mol/L HCI，使酶解液酸化后，采用陰離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化，本研究對(duì)比了Bond Elute Certify II 和Oasis MAX兩種商用SPE柱的效果，結(jié)果表明Oasis MAX的凈化效果和回收率優(yōu)于前者，本研究對(duì)固相萃取所用溶液、流速控制、淋洗和被測(cè)物的洗脫等條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)化合物性質(zhì)，DCBX、QCA和MQCA需要分兩步洗脫，第一步用二氯甲烷洗脫DCBX，第二步用含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫QCA和MQCA。

(2)液相色譜條件

1)色譜柱的選擇

比較了Phenomenex Luna C18、Waters Atlantis dC18以及Inertsil ODS-3等不同填料色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，使用Inertsil ODS-33um，2.1×100mm色譜柱時(shí)，各化合物的出峰時(shí)間、分離度和峰形較好。

2)流動(dòng)相的選擇

質(zhì)譜采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通常使用有一定酸度的流動(dòng)相，以使被分析物容易質(zhì)子化帶上正電荷，從而提高檢測(cè)的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)比較了0.05%～0.3%的甲酸溶液，結(jié)果表明，使用0.1%的甲酸溶液作為流動(dòng)相各組分得到比較好的分離，并且質(zhì)譜上有較強(qiáng)的響應(yīng)，故實(shí)驗(yàn)選擇0.1%的甲酸溶液作為流動(dòng)相。另外，流動(dòng)相體系還包括甲醇和乙腈，采用梯度洗脫，柱溫30℃，進(jìn)樣量30 μL。

(3)質(zhì)譜條件

動(dòng)物組織的成分復(fù)雜，樣品基質(zhì)容易對(duì)目標(biāo)分析物產(chǎn)生干擾，本研究采用電噴霧離子源(ESI)和正離子掃描方式進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)能有效的消除樣品基質(zhì)的干擾，大大提高方法的靈敏度。為了消除樣品基質(zhì)對(duì)離子化的抑制作用，在標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試樣品溶液中都加入已知量的內(nèi)標(biāo)QCA-d4。選取豐度最強(qiáng)的離子作為各組分的監(jiān)測(cè)離子，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，使每種化合物的分子離子與特征碎片離子的例子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大，四種化合物選定的質(zhì)譜條件為：離子源溫度： 450℃； NEB： 8.00； CUR： 7.00； CAD： 5.00； IS： 5000.00； EP： 10.00。

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