β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定公定方法（四）

時(shí)間：2023-03-25 08:10:29來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定公定方法（四）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.2.1.7 分析條件的選擇

(1)提取凈化條件的選擇

1)提取溶劑的選擇

β-興奮劑的提取方法主要有液液提取法和固相提取法(SPE)。除飼料中因直接添加β-興奮劑外，β-興奮劑在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、轉(zhuǎn)化、代謝，部分β-興奮劑可能成為結(jié)合型，如與葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結(jié)合。Boyd等l曾做過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，比較有無(wú)酶水解步驟對(duì)沙丁胺醇測(cè)試結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶水解后所測(cè)得的結(jié)果明顯高于未水解的(采用RIA方法測(cè)試)，有40%～45%沙丁胺醇是以結(jié)合物形式存在于肝樣品中。而Haasnoot等山報(bào)道，費(fèi)諾特羅在尿樣中大約85%是以葡糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化結(jié)合物形式存在，但是對(duì)于克倫特羅沒(méi)有數(shù)據(jù)證明是以結(jié)合的形式存在。

水解主要包括酸解和酶解。酶制劑本身及其水解的樣品往往可產(chǎn)生大量干擾物質(zhì)，且酶解條件受酶種類(lèi)、樣品基質(zhì)及水解條件不同而有所不同，而酸解的分析結(jié)果與酶解相近，且產(chǎn)生的干擾物質(zhì)較少。本方法采用酸解方式進(jìn)行水解，除使可能以結(jié)合態(tài)形式存在的化合物游離出來(lái)外，同時(shí)也使樣品基質(zhì)分散，便于提取。

樣品中β-興奮劑常見(jiàn)的提取溶劑有甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯-異丙醇、乙酸乙酯-正丁醇等。本方法結(jié)合12種β-興奮劑不同的極性，采用不同比例的乙酸乙酯-異丙醇進(jìn)行提取(添加水平5.0ug/kg，提取一次)，結(jié)果見(jiàn)表1-6，如果提取溶劑中異丙醇比例過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)不容易分層，而且濃縮不干的情況，所以，本實(shí)驗(yàn)中采用15mL乙酸乙酯-異丙醇(4+6，v/v)提取一次后，再采用10mL乙酸乙酯-異丙醇(7+3，v/v)進(jìn)行提取，提取回收率比較好，而且容易操作。

表1-6不同比例的乙酸乙酯-異丙醇混合溶劑對(duì)β-興奮劑的提取回收(添加水平5.0ug/kg)

2)pH的選擇

根據(jù)β-興奮劑在酸性情況下溶于水溶液，在堿性情況下溶于有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)中將12種β-興奮劑在不同pH的乙酸鈉緩沖液(0.2mol/L)用乙酸乙酯-異丙醇(4+6，v/v)進(jìn)行提取，得到結(jié)果見(jiàn)圖1-6(添加水平10.0ug/kg)，因此本方法中調(diào)節(jié)pH為9.4～10范圍內(nèi)進(jìn)行有機(jī)溶劑的提取，提取效率對(duì)12種β-興奮劑都較為穩(wěn)定。

圖1-6 β-興奮劑在不同pH的提取回收情況

3)凈化方法

β-興奮劑最常用的凈化手段是固相萃取法(SPE)、免疫親和色譜法(IAC)和液液凈化法等。常用于β-興奮劑提取的固相柱有硅藻土、C2、C8、C18、硅膠、強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和弱陽(yáng)離子交換柱等，所用的SPE柱有Bond Elut C18柱、C18和硅酸柱、酸洗硅酸柱、Bond-EIm Certify柱、Clean screen DAU cartridge柱等，也有用C18柱與SCX離子交換樹(shù)脂串聯(lián)的凈化方法。本方法采用C18與SCX結(jié)合性質(zhì)的Oasis MCX固相萃取柱，取得了良好的凈化效果，并比較了Oasis MCX與SCX的洗脫曲線，見(jiàn)圖1-7。從圖1-7中可以看出，至少要6mL 5%氨水甲醇溶液才能完全洗脫SCX柱上的沙丁胺醇。因此，實(shí)驗(yàn)中采用5%氨水甲醇溶液5mL洗脫，12種β-興奮劑都取得了較好的回收率。

4)過(guò)濾膜的影響

取含12種β-興奮劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過(guò)0.22um有機(jī)相和水相濾膜，發(fā)現(xiàn)有機(jī)相濾膜對(duì)克倫特羅，妥布特羅有明顯的吸附作用，而過(guò)水相濾膜基本上沒(méi)有損失，因此本方法采用過(guò)水相濾膜后進(jìn)樣。

圖1-7 12種β-興奮劑在MCX與SCX固相萃取柱上的洗脫曲線

洗脫溶劑：5%氨水甲醇溶液，1～3為淋洗液，4～12為洗脫液

5)基質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)

因上樣液中的雜質(zhì)對(duì)β-興奮劑藥物的檢測(cè)有一定基質(zhì)效應(yīng)，所以本方法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是以空白基質(zhì)的提取液來(lái)稀釋和配置的。

(2)儀器條件的選擇

1)內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的比較

由于所分析的12種化合物的結(jié)構(gòu)差異比較大，研究中對(duì)內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量進(jìn)行了比較，由于尚不能獲得12種化合物的同位素內(nèi)標(biāo)，本方法采用萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇三種同位素內(nèi)標(biāo)，實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確性明顯高于外標(biāo)法，尤其是對(duì)沙丁胺醇和特布它林這種絕對(duì)回收率較低的藥物，回收率明顯改善，這主要是由于同位素內(nèi)標(biāo)能很好地校正方法過(guò)程中的損失，以及基質(zhì)帶來(lái)的干擾和影響。因此，選擇內(nèi)標(biāo)法定量。

2)檢測(cè)條件的確定

按照質(zhì)譜測(cè)定的一般要求，先對(duì)各化合物進(jìn)行全掃描，隨后對(duì)每個(gè)化合物確定掃描離子，采用選擇離子模式以提高其檢測(cè)靈敏度。選擇兩對(duì)離子進(jìn)行MRM監(jiān)測(cè)即可滿足，其中母離子和子離子按照每種化合物的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)特性選取。

在所分析的化合物中，各物質(zhì)極性強(qiáng)弱不同，如特布它林、沙丁胺醇等含有極性較強(qiáng)的酚羥基官能團(tuán)，而克倫特羅和萊克多巴胺極性相對(duì)較弱，因此需要采用梯度洗脫方式來(lái)進(jìn)行分離。試驗(yàn)證明，在梯度洗脫條件下這12種物質(zhì)均能較好分離。

上一篇：β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定公定方法（三）

下一篇：磺胺類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)（二）