非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（五）

時間：2023-03-25 03:30:46來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

非甾類同化激素類藥殘留量測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(8)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析方法以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，以高特異性、高靈敏度著稱，可使分析過程簡化，適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析。主要有化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)、放射免疫法(RIA)、放射受體分析法(RRA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、時間分辨熒光免疫(TRFIA)和免疫傳感器等。

1)化學(xué)發(fā)光酶免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)

CLEIA是用參與某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測樣品中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉麄儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出待測物的濃度。

Zhu等建立了牛奶和尿液中ZER的CLEIA檢測方法。5mL樣品中加入15μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶于37℃酶解16h，勻漿3min，加入10mL乙腈，3500r/min離心10min，上清液于40℃水浴中氮氣吹干，10mL純水復(fù)溶，MAXSPE柱凈化，4mL甲酸-甲醇溶液(5+95，v/v)洗脫，40℃水浴中氮氣吹干，1mL磷酸緩沖液復(fù)溶。在微量板中加入100μL ZER-雞卵清白蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖液(1：5000)，4℃包被16h，洗滌3次，37℃封閉1h(150μL每孔)，洗滌3次，加入50uL抗ZER抗體(1：800000)，37℃封閉30min，洗滌5次，加入100μL化學(xué)發(fā)光底物液，酶標(biāo)儀檢測。方法的LOD為50ng/L，回收率為84.7%～123.6%。Jiang等開發(fā)了牛組織中ZER及其代謝物的CLEIA檢測方法。模擬分析物半抗原與小牛血清蛋白(BSA)結(jié)合，免疫獲得單克隆抗體，該抗體對ZAN具有很高的交叉反應(yīng)性。該方法的LOD為0.05μg/kg；回收率超過75%，CV小于15%。

2)放射免疫分析法(radioimmunoassav，RIA)

RIA是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原同抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)，反應(yīng)后分離并測量放射性而求得未標(biāo)記抗原的量。自20世紀(jì)70年代被首次用于檢測動物尿液中DES殘留以來，RIA被廣泛.地用于動物肌肉肝臟、尿液、牛奶中DES殘留檢測及DES在動物組織中代謝規(guī)律的研究上。

vanPeteghem等用RIA測定肉中DES殘留。樣品經(jīng)酶水解，乙醚提取，過SPE柱凈化后，RIA測定。LOD達(dá)0.07ng/g，回收率為64%～115%。Oeeffe等取小母牛頸部肌肉進行RIA分析檢測DES。樣品粗提物經(jīng)C18柱純化，DES的LOD可達(dá)40pg/g。Gaspar等用反相C18柱抽提和純化尿液，對22份未經(jīng)添加DES的動物尿液和76份已知不同添加濃度的動物尿液進行RIA分析。未經(jīng)處理的樣品DES測量值平均為0.07ng/mL；添加值1ng/mL時，添加樣本所測值與實際值相關(guān)系數(shù)為0.982。Stitch等認(rèn)為尿液中存在一種與DES結(jié)構(gòu)相似的酚類化合物，這被作為尿液檢測中假陽性出現(xiàn)比較高的-種解釋。RIA與其他技術(shù)聯(lián)合，如HPLC-RIA、Celite-RIA可以有效地去除樣品中雜質(zhì)對DES檢測的干擾、富集待測DES、提高檢測靈敏度。

3)放射受體分析法(radio receptor assay，RRA)

RRA是以受體蛋白作為特異性聯(lián)結(jié)劑，測定待測物(配體)的一種競爭性放射分析法。受體是細(xì)胞內(nèi)的一-種蛋白質(zhì)，它能與配體特異結(jié)合，且有高度親和力。它與RIA的分析原理基本相似，不同的是，RIA法是通過抗體與分析物結(jié)合，而RRA是通過受體與分析物結(jié)合。Arts等用RRA法測定小牛尿液中DES，LOD可達(dá)0.6ng/mL。他們給小牛注射50mgDES，然后用RRA法測定尿液，發(fā)現(xiàn)在用DES處理后第9天仍然可以在尿液中檢測出，與同時用ELISA檢測的結(jié)果近似。

4)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-link immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定，靈敏度高，操作安全，不需要昂貴的儀器，可以滿足大批量快速測定的需求。

Goldstein等用ELISA測定動物組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞中DES含量，檢測靈敏度是10ng/mL，與同時用RIA測定的結(jié)果相近

Sawaya等對綿羊尿液和雞肉做添加試驗，尿液的添加值為0.5～5ng/mL，用乙酸鈉緩沖液稀釋尿液，再經(jīng)C18柱純化，ELISA法測得綿羊尿液中DES的回收率為90%～106%；雞肉的添加值為0.2～1.5ng/mL，樣本經(jīng)叔丁基甲基醚反復(fù)抽提，C18柱純化，測得雞肉中DES的回收率為49%～68%。Li等27建立了雞和蝦組織中DES的ELISA檢測方法。雞和蝦組織經(jīng)乙腈-丙酮溶液(4+1，v/v)提取，三氯甲烷脫脂，ELISA檢測。該方法的LOD為600pg/mL，回收率大于79.5%，日內(nèi)、日間CV低于6%。

王鶴佳等建立了牛尿中ZER殘留的ELISA檢測方法。牛尿樣品6000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜，取0.5mL，加入3mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)；加入8μL β-葡糖醛酸酶/芳基酯酶，37℃孵育3h，C18柱凈化，用3mL甲醇和2mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)分別平衡C18柱，加入0.5mL樣品，2mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)和3mL 40%甲醇洗滌C18柱，正壓吹干，1mL 80%甲醇洗脫，氮氣吹干，用0.5mL稀釋液溶解殘留物，取50μL用于ELISA檢測。方法的LOD為0.6ng/mL，50%抑制濃度(IC50)為3.0ng/mL；以10ng/mL、21ng/mL和35ng/mL濃度添加空白牛尿，回收率在70.0%～116.0%之間，CV在6.0%～15.%之間。賀艷等建立了ELISA法檢測牛肉中ZER殘留，在1g牛肉樣品中加入2mL去離子水和8μL葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37℃水浴酶解2h，8mL乙腈振蕩10min，3000g以上離心5min，取上清5mL加入2mL三氯甲烷和6mL正已烷，渦動振蕩10min，3000g以上離心5min，去除上層正己烷，取中間層吹干后復(fù)溶，ELISA分析。方法的LOD為1.0μg/kg，添加回收率在72.4%～98.6%之間。Ana等采用ELISA方法篩查牛尿中的ZON。分析了50份樣品，除了4周歲小牛樣品外，均為陽性，最大濃度為241.1ng/mL。

5)時間分辨熒光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)

TRFIA是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，通過時間延遲，去除非特異性熒光干擾，在固定時間檢測特異性熒光，解決了自然背景干擾問題，極大地提高了分析靈敏度。Du等利用生物素鏈親和素放大系統(tǒng)建立了DES的TRFIA分析方法。銪(Eu)標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素衍生物與銪和二亞乙基三胺五乙酸酸酐偶聯(lián)作為標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素，與生物素結(jié)合的羊抗鼠IgG作為免疫測定中銷標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素與抗DES抗體之間的電橋，通過測定Eu+水楊酸(SA)在615nm熒光強度定量測定DES。該方法的線性范圍廣(0.001～1000.0ng/mL)，檢測血清中DES的LOD為0.81pg/mL，回收率為97.4%～107.8%，CV為1.32%-4.04%。

6)免疫傳感器(immunosensor，IS)

免疫傳感器法是將高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來，用以監(jiān)測抗原抗體反應(yīng)的生物傳感器，具備了免疫分析的高選擇性又兼有電化學(xué)分析的高靈敏性，易于實現(xiàn)殘留檢測儀器的便攜化、微型化和自動化，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點。Liu等建立了基于中空二氧化硅-納米金-多壁碳納米管(MSN-GNPs-MWCNTs)復(fù)合材料和辣根過氧化物酶抗體-普魯士藍(lán)-多壁碳納米管(HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs)檢測牛奶中DES的電化學(xué)免疫傳感器法。MSN-GNPs-MWCNTs復(fù)合材料作為固定基質(zhì)可以增強電極的電活性和穩(wěn)定性，HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs作為標(biāo)記物用來改進電極的催化活性。方法的LOD為0.12ng/mL，回收率為92%～107%。王傳現(xiàn)等建立了電化學(xué)免疫傳感器法檢測動物組織和奶粉樣品中的DES。將納米金(AuNP)修飾在電極.上，然后將石墨烯(Gr)-殼聚糖(CS)復(fù)合物飾于玻碳電極表面，通過循環(huán)伏安法對修飾的電極進行表征。以[Fe(CN)6] 3-/4-為氧化-還原探針，基于DES抗原抗體反應(yīng)引起[Fe(CN)6]3-/4-探針的電流響應(yīng)的變化，來實現(xiàn)對DES的檢測。DES的質(zhì)量濃度在0.5～1500.0ng/mL范圍，與峰電流呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.985，LOD為0.1ng/mL。檢測豬肉、牛肉、鴨肉和奶粉中DES的回收率分別為71.2%～117.7%、80.5%～110.1%、80.8%～117.8%和72.3%～117.2%。

Feng等采用納米多孔PtCo合金作為抗體的載體制備免疫傳感器，將ZER抗體偶聯(lián)到玻碳電極，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無酶的米多孔PtCo合金免疫傳感器對抗原抗體反應(yīng)具有極強的點催化活性，檢測牛尿中的ZER的檢測限為13pg/mL。Feng等又將納米蒙脫石轉(zhuǎn)化為鈉蒙脫石(Na-Mont)，用于硫堇(TH)、辣根過氧化物酶(HRP)和次級抗ZER抗體(Ab2)的固化。修飾后的微粒(Na-Mont-TH-HRP-Ab2)被用作免疫傳感器檢測ZER的標(biāo)記物。采用固定有一級抗體(Ab1)，表面用玻碳電極(GCE)修飾的納米多孔金膜(NPG)制備免疫傳感器。在0.01～12ng/mL濃度范圍，ZER的相關(guān)系數(shù)r為0.9996；LOD為3pg/mL。

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